第三節 動脈血管壁細胞間質成分的提取
動脈血管壁膠原提取的基本方法是，首先除去凝血等其他雜質，由于膠原為桿狀三螺旋結構，能耐受胃蛋白酶的作用，但是兩端球蛋白結構能被胃蛋白酶水解。膠原纖維內分子間的共價交聯是由分子末端賴氨酸或羥賴氨酸形成，用胃蛋白酶切斷末端交聯結構，使膠原分子的巨形結構被破壞，從完整分子可提出各種類型的膠原。
（一）膠原的初步分離
1．小心取出動脈血管，用0.05mol/L BPS pH7.8洗凈凝血塊，3kr/min離心10min。
2．冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪，蒸餾水洗滌3次。
3．將組織破碎，加三倍體積組織勻漿處理液（0.5mol/L乙酸，pH2.5，1%胃蛋白酶）于4℃48h,16kr/min離心45min，同樣方法重復3次。
4．向留取的上清液中緩緩加入NaCl，最終達到4mol/L濃度，攪拌12～24h，15kr/min離心45min，棄上清。
5．進一步分離各種膠原可用分段鹽析和柱層析法進行操作。
（二）膠原的分段鹽析
1．取初級提取物加0.1mmol/L乙酸，加NaCl至0.7mmol/L，15kr/min離心20min。沉淀提取Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，上清提取Ⅳ、Ⅴ型膠原。
2．沉淀，加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保濕16h，10kr/min離心20min，上清液加NaCl至4mol/L，離心，沉淀物為Ⅳ型膠原。
3．1mol/L NaCl溶解沉淀，加3倍體積Tris-HCl pH7.4，10kr/min離心20min，沉淀為Ⅲ型膠原。
4．上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min離心20min，沉淀為Ⅰ膠原。
5．取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min離心20min。
6．沉淀溶于4倍體積1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4，加NaCl至4mol/L 10kr/min離心20min。
7．上清加NaCl至4mol/L，調pH到3.5,離心得沉淀再加5倍體積0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液懸浮16h，小心取上清加NaCl至4mol/L，10kr/min離心10min，沉淀為Ⅳ型膠原。
8．將6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE懸浮16h，上清加NaCl至4mol/l,10kr/min離心10min，沉淀為Ⅴ型膠原。
（三）將初步提取的膠原加到DEAE纖維柱上，用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脫，230nm波長檢測洗脫物。因為膠原在pH7.5時均帶正電荷，不與DEAE柱結合，所以被柱結合的則為非膠原蛋白。
二、蛋白多糖的提取蛋白多糖具有可溶于4mol/L鹽酸胍的性質，再經DEAE-纖維素層析除去其他雜質，非蛋白多糖與蛋白多糖用不同濃度尿素可分段層析分開。
1．取動脈血管小心除去血管周圍脂肪組織和纖維膜，用冷0.5mol/l PBS pH7.8洗滌，2kr/min離心10min。
2．用勻漿器破碎，加入15倍體積的提取液（0.05mol/L乙酸pH5.8、4.0mol/L鹽酸胍、0.1mol/l6-氨基乙酸EDTA、3mol/L芐脒），于4℃緩慢振蕩24h，10kr/min離心30min。
3．取上清透析濃縮30倍。
4．將提取液加入已經平衡好的DEAE-纖維素柱上，分別用0.15mol/l NaCl和2mol/LNaCl洗脫，均用280nm波長紫外監測儀連續監測。
三、彈性蛋白的提取提取方法較多，各有優缺點。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L鹽酸胍抽提，再用膠原酶水解其他非彈性蛋白組分，最后還原二硫鍵，分離提取彈性蛋白。具體方法如下：
1．將動脈血管壁洗凈，小心除去附著結締組織。
2．將血管壁組織浸于4℃ 50%的吡啶液，破碎組織，3kr/min離心15min。
3．取沉淀用蒸餾水洗滌3次，真空干燥后研成粉末。
4．將粉末懸浮于2mol/L NaCl,4℃攪拌24h，3kr/min離心20min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗3次。
5．將沉淀用無水乙醇脫脂20min，用氯仿-甲醇（2：1）處理20min，再用乙醚沖洗干燥，3kr/min離心20min，真空干燥沉渣。
6．干燥的沉淀物用5倍處理液（0.5mol/LCaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5、2%膠原酶）洗滌，3kr/min離心20min。
7．將沉淀移入帶塞的瓶中，加含0.5mol/L鹽酸胍、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇，2.0mol/L EDTA液4℃過夜。
8．3kr/min離心20min，沉淀用蒸餾水洗滌2次。
9，沉淀物加入處理液（6mol/L尿素、0.1%SDS、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7），通過氮氧真空過夜，3kr/min離心20min。
10．沉淀再真空干燥，即為彈性蛋白。
四、粘連蛋白的提取提取粘連蛋白的基本原理是用NaCl脫氧膽酸鈉液提取血管壁中的粘連蛋白，再用高鹽除去雜質，然后進一步用Sephacryl層析純化，方法如下：
1．將動脈血管壁組織加10倍體積處理液（0.05mol/lTris-HCL pH7.6、0.5%核酸酶），4℃攪拌20min，10kr/min離心10min。
2．沉淀用含0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、10%甲醇液，洗滌2次，10kr/min離心10min。
3．沉淀物中，加40倍體積處理液（0.05mol/lTris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/LNaCl,）4℃過夜后，10kr/min離心10min。
4．上清用PEG6000濃縮，最后加入已平衡好的SephacrylS-3000層析柱上，用0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%NaCl洗脫，第一峰即為粘連蛋白。