第二節 DNA的序列測定
核酸的序列分析，即核酸一級結構的測定，是現代分子生物學中一項重要技術。目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977年）提出的雙脫氧鏈終止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化學降解法，其中雙脫氧鏈終止法是目前應用最多，最好的技術。
一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理
通常DNA的復制需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3‘-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指導，不斷地將dNTP加到引物的3‘-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙 脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因為它與普通dNTP不同，在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基，故不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵。例如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為α-32P標記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5‘-引物端和以ddC殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段的混合物。經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準確信息，從而將全部C的位置確定下來。采用類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物全部平行地點加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列，見圖24-3所示。
圖24－3 雙脫氧鏈末端終止法測序基本原理示意圖
二、雙脫氧鏈止終法測定戰略
由于DNA一般都由幾千個單核苷組成。而目前測定DNA序列的最好方法，一次也只能測約600個核苷酸，因此進行DNA順序測定前，需要用不同限制酶消化等測DNA，使其降成小片段，分別克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等載體中，分別測定各小片段的順序，由于不同限制酶產生的片段之間有交錯重疊順序，根據片段間和末端重疊序列，用計算機軟件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，進而排出DNA的全序列。
三、雙脫氧鏈終止法測定方法
以M13噬菌體為載體的雙氧鏈終止法的實施步驟為例：
1．M13噬菌體復制型雙鏈DNA（RFDNA）的制備。
為了將待測雙鏈DNA進行克隆，必須制備M13mp18或M13 mp19復制型（閉環雙鏈）DNA，從M9培養基中，挑起單個克隆大腸桿菌，JM101到50ml2×YT培養基中，37℃振蕩過夜。稀釋1ml培養物到50ml2×YT培養中，于37℃振搖6h，轉移2ml培養物于微量離心管中，12000g，離心5min細菌沉淀保留用于分離復制型RFDNA，上清用于分離噬菌體單鏈DNA。
細菌沉淀用于分離復制型DNA，可以采用標準的堿解方法或采用天美公司的Wizard Miniperps DNA試劑盒制備。（方法同分離質粒DNA方法）。
2．重組噬菌體制備
采用多克隆位點上的限制性內加酶切割待測DNA，并采用相同內切酶切割M13噬菌體RFDNA（采用Biol 101gene clean Ⅱ試劑盒分別純化內切酶切割后的DNA片段），然后將待測外源DNA片段與M13復制型載體DNA連接過夜，連接反應物轉染JM101感受態細菌，將連接物10μl與200μl感受態細菌混勻，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鮮的靜止相JM101培養物混勻，然后分別以300μl于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培養基上，于37℃培養8h即可出現藍色和白色噬斑，白色或稱無菌噬斑，即為陽性重組噬菌體。
3．單鏈噬菌體DNA（模板DNA）的制備
上述平板的每個白色噬菌斑是由一種重組M13DNA分子轉染細菌后產生的，如果取一個白色噬菌斑進行培養便可得到一種單鏈形式的DNA。為此，挑取一個白色噬菌斑轉接到一個新鮮制備的OD600=0.1的大腸桿菌JM101培養物中，于37℃振搖5h左右，12000g離心10min，上清轉移到另一新微量離心管中用于分離單鏈DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5m NaCl 200μl沉淀噬菌體，再用飽和酚抽提除去噬菌體蛋白，最后用1/10體積的3m NaAc和乙醇沉淀單鏈DNA，濃度調至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的Wizard TM M13DNA純化試劑盒分離純化M13單鏈DNA。
4．引物制備
可以購買通用引物或實驗室合成15bp～26bp長度的引物，通常以2μg/ml的濃度貯存于-20℃備用。
5．微量滴板
進行大批量的模板測序時，常在密閉的微量離心管中進行與引物的退火反應，然后在微量滴板中進行鏈延伸-鏈終止反應。
6．變性聚丙烯酰胺凝膠
測序凝膠裝置的大小形狀均不相同，其主要參數有：①長度通常為40～50cm；②寬度通常為20cm；③厚度通常為0.3～0.4mm；④橫截面形狀為楔形或錐形，即頂部薄，底部厚，或者是將底部凝膠緩沖液的濃度提高；⑤加樣槽；⑥整塊凝膠上的溫度應均一。
7．電泳后將凝膠干燥，放射自顯影。
8．凝膠上讀取DNA序列。
此時讀取的是目的DNA的互補鏈3‘～5‘的序列。