附錄 WHO推薦的白喉類毒素效價測定方法
可選用以下兩種方法之一種進行。
（一）Vero細胞測定抗體法
1 免疫與采血
用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品以2倍稀釋法稀釋成3～5個適當稀釋度，每一稀釋度樣品免疫體重10～14g小白鼠8只，皮下注射0.5ml，免疫5周后，每個小白鼠采血，分離血清，56℃30分鐘滅活，放-20℃保存。
2 毒素試驗量測定
Vero細胞測定白喉抗體試驗時毒素試驗量采用Lcd/10000。
在96孔培養板中用RPMI1640（或199）培養液將毒素做2倍系列稀釋，每孔50μl，然后向各孔中加入50μl標準白喉抗毒素（0.0001IU），用膠帶密封，在室溫放置1小時后，加入50μlVero細胞懸液（見3項）密封，放37℃CO2孵箱培養6～7天后，觀察結果，使細胞死亡的最大毒素稀釋度孔（紅色）就是Lcd/10000。
Lcd/10000的毒素量約相當于1×10-4Lf的毒素適用于本試驗。
3 Vero細胞
RPMI1640（或199）培養液（加青霉素100IU/ml，鏈霉素100μg/ml，胎牛血清10%）。Vero細胞培養于150cm2培養瓶中，待細胞長成占瓶底80%～100%單層時，棄去上層培養液，加10ml0.25%胰酶，放37℃數分鐘，棄去胰酶，加入10ml培養液，打勻細胞進行計數（1瓶150cm2培養瓶大約可得10～40×106細胞）。用培養液調整細胞濃度至2.5×105細胞/ml。
4 陽性對照小白鼠血清
用吸附白喉類毒素免疫1批小白鼠，免疫5周后采血，分離血清，分裝小管，冷凍干燥，保存于-20℃。
5 抗體滴定
按下圖將培養板編號：
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
B1
C1
D1
E1
F1
G1
H1
（1）向每孔加入50μl培養液，但A11、A12和H11、H12孔不加，而G11、G12加100μl培養液。
（2）取8份待檢血清，分別加入A1至H1孔各50μl，橫向進行2倍系列稀釋，直至A10和H10孔。
（3）將標準白喉抗毒素稀釋至0.008IU/ml，加入A11、A12、B11和B12孔各50μl，從B11和B12孔開始豎向做2倍稀釋至D11和D12孔。
（4）H11和H12孔加入陽性小白鼠對照血清50μl。
（5）除G11和G12孔外，向其余各孔中加入毒素（Ldc/10000）50μl，輕輕轉動培養板，混勻，在培養板上貼上膠帶將板孔封閉，放室溫1小時。
（6）收集Vero細胞，進行計數，并稀釋成2.5×細胞/ml的Vero細胞懸液。
（7）室溫放置1小時之培養板，去膠帶，立即加入50μlVero細胞懸液，再用膠帶封閉培養板，放37℃CO2孵箱培養6天。在24小時及48小時檢查膠帶封閉情況，如出現封閉不嚴應更換。
（8）培養6天后取出培養板，根據培養液顏色變化記錄結果，黃色為（+），紅色為（-），羲色不明顯者則可用顯微鏡觀察，如單層細胞完整無損則為（+），否則記錄（-）。最終結果以打分表示，即變成黃色的最高稀釋度孔的2的指數，例如：變黃的最后一孔是1/256即28，則結果記為8。
6 試驗要求
E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero細胞敏感度都出現（-），如果出現（+），則毒素量和細胞敏感度都很低，應重試。
細胞孔G11、G12和陽性對照孔H11、H12必須是（+），如出現（-），應重視。
Lcd/10000毒素量的準確性，根據以上計劃下列各孔中所加標準抗毒素為：
孔A11和A120.0004IU
B11和B120.0002IU
C11和C120.0001IU
D11和D120.00005IU
如毒素用量準確（Lcd/10000），則A11、A12和B11、B12孔應為（+），而C11、C12和D11、D12應為（-），否則應重試。
7 結果計算
用平行線分析法進行結果計算
8 結果判定
待檢樣品的效價每劑量應不少30IU。如95%可信限大于50%～200%，則95%可信限的低限效價應大于30IU/1個人用劑量。
（二）豚鼠毒素攻擊法
1 免疫及攻擊
用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品稀釋成等比間隔的3～5個稀釋度（中間的稀釋度必須在攻毒后能保護約半數動物），每一稀釋度樣品免疫體重250～300g之豚鼠至少10只，另外5只豚鼠不注射作為對照。免疫后4周，每只免疫豚鼠攻擊白喉毒素100LD50，皮下注射1.0ml。對照組健康動物注射100倍稀釋之上述毒素，每只皮下注射1.0ml。攻擊毒素后觀察5日，每日記錄結果。
2 試驗成立應具備的條件
（1）檢品的最低稀釋度能保護半數以上動物。
（2）檢品的最高稀釋度保護半數以下動物。
（3）對照組動物應部分死亡而不全部死亡。
（4）檢品和標準品的劑量反應曲線在平行性及直線性上沒有太大的偏差。
3 結果計算及結果判定
見Vero細胞法7和8項。