附錄2 人凝血因子Ⅷ效價測定（二步法）
1 材料
1.1試劑
1.1.10.05mol/L CaCl2溶液
稱7.35gCaCl2·2H2O（分析純），加蒸餾水溶解，稀釋至1000ml。
1.1.20.025mol/L CaCl2溶液
稱3.675gCaCl2·2H2O（分析純），加蒸餾水溶解，稀釋至1000ml。
1.1.3 咪唑緩沖液
稱0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于約100ml蒸餾水中，加37.2ml0.1mol/l HCl，加蒸餾水至200ml，pH為7.3～7.4。
1.1.4 枸櫞酸鹽-氯化鈉溶液
1份3.8%枸櫞酸三鈉溶液加5份0.85%NaCl溶液混勻。
1.1.5Al(OH)3膠
a稱（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63℃蒸餾水中。
B稱氨明礬19.175g，溶于250ml58℃的蒸餾水中。
C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸餾水。
三種溶液配畢后，立即將c液迅速倒入a液中攪勻，然后在攪拌下將此混合液迅速倒入b液，用力攪拌10分鐘（保持溫度不低于58℃），離心（2500r/min，15分鐘），棄上清，沉淀洗滌5次。
第一次：用75ml蒸餾水加0.055ml氨水（比重0.88）混勻，離心，棄上清。
第二次：用75ml蒸餾水加0.11ml氨水（比重0.88）混勻，離心，棄上清。
第三、四、五次分別用75ml蒸餾水洗。
將沉淀物懸浮于總體積為175ml蒸餾水中，混勻，分裝，4℃保存。
1.1.6 正常人血清
分別收集20份以上正常人血于干燥滅菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37℃保溫5～6小時，置4℃冰箱過液，分離血清，混勻，定量分裝（0.5ml/安瓿），冷凍干燥，-20℃保存。
用時，取凍干品1支，按標示量加蒸餾水溶解，然后用咪唑緩沖液作1∶10稀釋，4℃冰箱過夜（使血清活化），試驗當日再用咪唑緩沖液作最適濃度稀釋（一般為1∶20），置冰浴備用。
1.1.7 牛Ⅴ因子
收集公牛血于干燥滅菌的玻璃容器中，室溫放置4小時，離心（2500r/min，30分鐘），分離血清，取血清加10%（g/ml）BaSO4在室溫下攪拌吸附40分鐘，離心（2500r/min，40分鐘），棄沉淀，定量（1ml/瓶）分裝，冷凍干燥，-20℃保存。
用時取凍干品1支，按標示量加蒸餾水溶解，用生理鹽水作最適濃度稀釋（一般為1∶20），置冰浴備用。
1.1.8 磷脂
取新鮮腦（人，牛，兔），除去表面血管、腦膜，盡可能除去白質，切成薄片，稱重，輕輕搗碎，用3倍腦組織的丙酮提取5次，每次用雙層綢布濾干，最后腦粉于37℃干燥1小時，稱取腦粉1g，加20ml氯仿提取，于室溫振搖2小時后，用單層濾紙過濾，濾液放抽氣柜內用吹內機吹至微干，加10ml生理鹽水研制成白色均勻乳狀液，定量（0.1ml/瓶）分裝，冷凍干燥，-20℃保存。
用時，取凍干品1支，按標示量加蒸餾水溶解后，用鹽水作最適濃度稀釋（一般為1∶100～1∶500），置冰浴備用。
1.1.9 基質血漿
正常枸櫞酸血漿，按3ml分裝，-20℃保存。
1.2標準品和樣品。
2 操作
2.1試劑混合
取稀釋人血清、Ⅴ因子、磷脂等量混合，置冰浴30分鐘后備用。
2.2標準品、樣品的準備和稀釋
2.2.1 若試驗血漿對標準血裝（標準血漿為未吸附者）：二者按1ml血漿加0.1ml Al(OH)3懸浮液混合，置37℃水浴吸附3分鐘，離心取上清備用。
2.2.2 試驗血漿對濃縮標準或試驗濃制品對標準血漿：用Ⅷ因子嚴重缺乏的血漿（Ⅷ因子含量＜1%）稀釋濃縮標準品或試驗濃制品使成0.5～1.0IU/ml，然后按2.2.1法進行吸附處理。
2.2.3濃縮試驗品對濃縮標準品：直接溶解稀釋成0.5～1.0IU/ml。
2.2.4標準品和檢品準備好后，立即用枸櫞酸鹽一氯化鈉溶液分別作3個連續倍倍稀釋，使最低和最高稀釋度的凝結時間在17～35秒間（一般為1∶16～1∶256）
2.3 測定
2.3.1 第一步，混合物的保溫
取7支玻璃凝集管放入冰浴中，每管加0.3ml混合試劑，然后于第1、2、3管分別加高、中、低稀釋度的標準品各0.1ml，第4、5、6管分別加高、中、低稀釋度的樣品各0.1ml，第7管加枸櫞酸鹽-氯化鈉溶液0.1ml（作空白）；從第1管開始逐管移入37℃水浴，加0.05mol /L預溫CaCl2溶液0.1ml，混勻，記時。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的時間間隔均為1分鐘。
2.3.2 第二步，凝血酶原激活物生成量的測定（取樣時間以15分鐘和21分鐘為例）
另取13支凝集管，每管各加入0.025mol/l CaCl2溶液0.2ml，當第一步第1管保溫至12分鐘時，將此13支凝集管和1支裝有基質血漿的試管放入37℃水浴中，待混合物保溫至14分鐘40秒時，從第1保溫管中取出0.1ml混合物加到1支含有0.025mol/l CaCl2溶液的凝集管中，于15分鐘時，加入0.2ml基質血漿混勻，另用一只秒表記錄從基質血漿加入到纖維蛋白形成所需的時間（纖維蛋白形成可用肉眼觀察，也可用儀器測量），其余各管每隔1分鐘如此依次進行，并于第21～26分鐘作第二系列測定，兩系列所測得凝結時間不應相差5%（說明穩定的凝血酶原激活物已形成，否則保溫時間應調整）。空白管于第27分鐘時取樣測定。
為了消除試驗順序誤差，將標準品和樣品的試驗順序改變，2.3.1及2.3.2項過程重復一次。
2.4 計算
2.4.1 作圖法
用雙對數紙，以凝結時間（秒）為縱坐標，稀釋度（如25%、50%、100%……）為橫坐標，分別將標準品和樣品兩套試驗結果的平均凝結時間作兩條平行線，從100%含量的稀釋度處作一垂直線與試驗線相交，通過交點作一水平線與標準線相交，再通過交點作一垂直線與橫坐標相交，其交點讀數即為試驗樣品相當于標準品的百分含量。若標準線和試驗線的直線性、平行關系有顯著性差異，或空白試驗小于40秒，則分析結果無效。
2.4.2 用3.3平行線法公式計算
樣品效價（IU/ml）=log-1（I·V/W）標準品效價·樣品稀釋倍數×D值
I=0.301(2倍系列稀釋法的常數)
V=1/3（T1+T2+T3－S1―S2―S3）
T1、T2、T3為樣品3個倍倍稀釋度的凝固時間（秒）
S1、S2、S3為標準品3個倍倍稀釋度的凝固時間（秒）
若V為負值，變為正值后再代入上面公式計算，若V為正值，變成負值后再代入上面公式計算。
W=1/4（T3－T1＋S3－T1）
D值=標準品的最大稀釋度/樣品的最大稀釋度
3 注意事項
3.1因Ⅷ因子易變不穩定，因此在進行標準品和樣品的稀釋時，應快而準確，稀釋后立即檢定，冰浴中不得放置30分鐘以上。
3.2試驗中各試劑的最適稀釋度和混合物保溫時間隨試劑的變化而異，故應作試驗預測，稀釋試劑應在冰浴中放置，使用時間超過半天應重新配制。