結核菌素純蛋白衍化物（TB-PPD）制造及檢定規程
本品系用結核桿菌經液體表面培養、蒸汽殺菌過濾除去菌體，用沉淀分離、洗滌及再溶解的提純方法制成的液體或凍干制品，含有從結核桿菌培養濾液中獲得的活性物質，其主要成分是蛋白質，對已受結核菌感染或曾接受卡介苗免疫的機體，能引起特異的皮膚變態反應。用于檢查結核桿菌的感染及觀察免疫反應。
1 菌種
1.1 菌種由中國藥品生物肉制品檢定所分發或經同意。
1.2 制造TB-PPD用人型結核桿菌，菌號93009（H37Rv）。菌種應有完整的歷史資料，經過全面檢定，凍干保存。
1.3 應制備生產用菌種批，次級菌種批應控制在5代以內。
2 制造
全部生產過程，包括殺死分枝桿菌，應在完全隔離的區域內用專用設備進行。
2.1 制造用培養基
使用蘇通馬鈴薯培養基，改良蘇通綜合培養基，或其他適宜培養基。培養基中應不含已知能對人或動物造成毒性和變態性反應的成分。
2.2 啟開菌種（菌種批）反接種于蘇通馬鈴薯培養基上。置37℃培養2～3周，可在蘇通馬鈴薯培養基上再傳一代或直接挑取蘇通馬鈴薯管內生長良好的菌膜，移種于改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基的表面，置37℃靜止培養1～2周，供大量接種用。
2.3 大量接種
挑取發育良好的菌膜移種于改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基的表面，置37℃靜止培育8～10周。凡在培養期間或培養終止時，有菌膜下沉、發育異常或污染雜菌者，必須廢棄。
2.4 殺菌
培養終止，將培養物加熱，121℃30分鐘進行殺菌處理。
2.5 除菌
殺菌后用濾器除去菌膜及菌體，收集濾液并取樣做無菌試驗，然后，加入0.3%苯酚或其他適宜的防腐劑。濾液保存在4～8℃，但要防止凍結。
2.6 提純
用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉淀蛋白，加壓過濾除去清液，并收集沉淀物于3μm孔徑的濾膜上，然后用10%氯化鈉液洗酸脫鹽至中性為止，最后以磷酸鹽緩沖液將沉淀物溶解，除菌過濾后即為原液。亦可采用其他適宜方法提純。
2.7 分批
每次提純的原液作為1亞批。最多將5個亞批混合組成為1批。
2.8 半成品檢定
2.8.1 物理檢查
原液應為深棕色的澄明液體，不應有沉淀物或其他雜質。
2.8.2 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規程》進行。
2.8.3 安全試驗
用體重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射原液1.0ml，觀察6周，檢查其癥征或死亡。所有在試驗后24小時內死亡的或表現出癥征的動物應作鏡檢，然后將有關的組織鏡檢和培養，檢查其有無分枝桿菌存在的證據。觀察期中活存的動物也要以同樣方法檢查。
如果分析桿菌活菌培養試驗陰性，在觀察期中全部豚鼠健康存活，無一動物出現分枝桿菌的癥征，則可判定濃縮原液通過試驗。
如果未到觀察期，任何動物死于非結核病因，本試驗可復試一次。
2.8.4 致敏效應試驗
實驗組與對照組分別用體重300～400g未做過任何試驗的健康豚鼠各3只，實驗組每只豚鼠皮內注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品，共3次，每次間隔5天，在第3次注射后15天，實驗組與對照組每只豚鼠各皮內注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品，連續觀察3天，兩組動物反應不應有明顯區別。
2.8.5 純度測定
應測定蛋白（凱氏定氮法）、多糖（蒽酮法）與核酸（紫外分光光度法）含量。蛋白含量應≥90%，多糖含量≤3%。
2.8.6 效價測定
TB—PPD標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。
2.8.6.1 動物試驗
將標準品及待檢原液分別稀釋馬0.1ml含100IU、20IU及4IU或其他適宜的稀釋度，用體重400～600g已致敏的白色雌性豚鼠最少4只，去毛后于背部脊柱兩側相對部位，分別皮內注射上述稀釋度各0.1ml（從尾側起先注射稀釋度最高者）。于注射后24、48小時各觀察結果1次（可根據48小時的反應結果判定），算出待檢和標準TB-PPD的平均硬結反應（縱橫直徑相加除2）計算累計值，并求其比值，比值1±0.2者為合格。
也可按WHO規程要求，標準品及待檢樣品分別稀釋3個不同的適宜稀釋度，用6只致敏豚鼠，以輪圈法注射于豚鼠背部兩則，每側3點，每點皮內注射0.1或0.2ml樣品，用雙盲法分別記錄24及48小時局部硬結的縱徑與橫徑。計算每個稀釋度2天的總和（也可計算2天的平均面積），并求其比值，比值1±0.2者為合格。
稀釋度的選擇應能使注射后24小時所產生的局部硬結反應直徑不小于8mm，不大于25mm，兩個樣品的反應直徑大致相同及兩個樣品的3個稀釋度的劑量對數反應線應基本平行。
如待檢樣品效價與標準品效價不一致，可用同樣方法重試一次，并算出相當于標準品的效價進行調整，調整后再重新抽樣測定效價，直至合格。
2.8.6.2 人體反應測定
動物試驗合格后，應進行小量人體測定，選擇對TB—PPD1IU（好0.02μg結核蛋白）反應陽性的敏感成人最少5人或者皮內接種卡介苗12周后免疫效果觀察的嬰幼兒至少20人，每人于兩前臂內側相對部位分別注射5IU的標準品與待檢樣品各0.1ml，注射后72小時觀察結果，并求其比值（計算方法與2.8.6.1項相同）。比值1±0.2，并無1例異常反應者為合格。
2.9 分裝凍干
經物理檢查、無菌試驗、安全試驗、致敏效應試驗、蛋白質含量及效價測定合格后，即可根據蛋白質含量將原液進行定量稀釋至規定濃度，然后定量分裝安瓿，每安瓿裝量為0.5ml，分裝后立即進行凍干。每安瓿的分裝誤差應符合標準品的要求（差異系數不超過1%）。
凍干后抽樣做成品檢定，亦可將原液保存備用。
3 濃縮物檢定
3.1 物理檢查
凍干TB—PPD應為白色疏松體，無融化跡象。加入稀釋液后，應于3分鐘內全部溶解，呈棕黃色澄明液體，不得有不容物或雜質。
如系液體原液，亦應為棕黃色澄明液體，不應有不溶物或雜質。
3.2 水分測定
凍干制品水分含量應≤3%。
3.3 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規程》進行。
3.4 安全試驗
按2.8.3項進行。
3.5 純度測定
按2.8.5項進行。
3.6 致敏效應試驗
按2.8.4項進行。
3.7 效價測定
動物試驗按2.8.6.1項進行。人體反應測定按2.8.6.2項進行。但觀察人數需增加1～2倍。
3.8 保存與效期
保存于2～8℃冷暗處。凍干制品自效價測定合格之日起效期為10年。液體原液自效價測定合格之日起效期為5年。
4 TB—PPD和稀釋
4.1 稀釋
經檢定合格的濃縮物用內含0.0005%吐溫80及0.3%苯酚的pH7.2～7.4的0.01mol的磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至20IU或50IU。
各處稀釋用具應專用。加入TB—PPD后應充分搖勻，并逐瓶抽樣作無菌試驗，合格后分裝。
4.2 分批
每次稀釋的同一濃度的稀釋TB—PPD為一批，同時有數瓶者，按瓶分為亞批。
4.3 分裝
由專人用專用工具進行。
5 成品檢定
5.1 物理檢查
分裝后應進行破漏、裝量、外觀檢查。應為無色澄明液體，不得有不容物或雜質。
5.2 化學檢查
pH值應為6.8～7.4。苯酚含量應為0.25%～0.5%。
5.3 無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規程》進行。
5.4 防腐劑試驗
用體重18～20g小白鼠2只，各皮下注射樣品0.5ml，小白鼠震顫時間不得超過半小時，觀察7天，不得有局部膿腫或死亡。
5.5 安全試驗
每批用體重18～20g小白鼠5只，各腹腔注射樣品0.5ml，觀察1周，小白鼠應健康活存。
5.6 效價測定
按2.8.6.1項進行。比值1±0.2者為合格。
6 保存與效期
保存于2～8℃暗處。自稀釋檢定合格之日起效期為1年。