精制抗毒素制造及檢定規程
本規程適用于白喉、破傷風、氣性壞疽及肉毒四種精制抗毒素。
精制白喉、破傷風、氣性壞疽、肉毒抗毒素系分別由各該抗毒素的馬血漿經胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干抗毒素球蛋白制劑。分別用于各該疾病的預防和治療。
1 制造
1.1對血漿的要求
1.1.1制造精制抗毒素的血漿，應符合附錄1《抗毒素生產用馬匹免疫方法》的規定。在保存期間如發一周明顯的溶血、染菌及其他異常現象，不得投入生產。
1.1.2血漿的抗毒素效價不得低于下列要求：
血漿種類每瓶血漿效價（IU/ml）
白喉1000
破傷風1000
威氏250
膿毒300
水腫550
溶組織550
A型肉毒1000
B型肉毒600
E型肉毒600
以上效價均以動物測定方法為準。
1.2制造程序
1.2.1消化
1.2.1.1第1法
血漿用2～4倍水稀釋，調節pH至3.2～3.6，加入胃酶適量及甲苯0.2%～0.4%（ml/ml），于29～31℃消化1～1.5小時。
1.2.1.2第2法
血漿用2～4倍水稀釋，調節pH至3.6～4.0，加入胃酶適量及甲苯0.2%～0.4%（ml/ml），于22±℃消化20～22小時。
1.2.2第1次沉淀及加熱處理。
每100ml消化液加硫酸銨14～16g，白喉及破傷風抗毒素調節pH至4.8～5.6，氣性壞疽及肉毒抗毒素調節pH至4.5～5.0；白喉、破傷風、氣性壞疽抗毒素加溫至57～57℃，肉毒抗毒素加溫至50～52℃，均保持30分鐘。加溫終了，盡速降溫至45℃以下，分離，取清液。
1.2.3第2次沉淀
上述清液調節pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸銨19～21g，分離，取沉淀，壓干。
上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過2%（g/ml），加明礬不少于0.8%(g/ml)，調節pH至7.7～7.9，分離，取清液。
1.2.5濃縮
1.2.5.1第1法
將上述清液第100ml加硫酸銨38g，分離，取沉淀，壓干。沉淀物透析至硫酸銨含量0.1%（g/ml）以下。
1.2.5.2第2法
將上述清液混合，通過超濾裝置進行超濾，濃縮至硫酸銨含量為0.1%（g/ml）以下。
1.2.6最后處理
上述透析后的血清進行下列處理：
1.2.6.1調整固體總量不超過20%（g/ml）。蛋白含量不超過17%（g/ml）。
1.2.6.2加氯化鈉使最終含量為0.9%（g/ml）。
1.2.6.3加三氯甲烷使最終含量為0.5%（ml/ml）或硫柳汞液使最終含量為0.01%(g/ml)為防腐劑。用于制造凍干抗毒素者只用三氯甲烷為防腐劑。
1.2.6.4調節pH至6.0～7.0。
1.2.6.5除菌過濾，并做無菌試驗。
1.2.7凍干
經除菌過濾及半成品檢定合格的精制抗毒素，可用凍干法制成干燥制品。
1.3對制造工藝的要求及規定
1.3.1制造室內部裝修材料應便于清潔消毒，地面耐腐蝕，室內盡可能低溫，力爭做到無菌操作。
1.3.2所用儀表和量具應精密準確，并經常校正。一切與血漿接觸的器皿、用具等，應注意不染有熱原質，不含有毒物物質。消化液加熱處理前后的器皿、用具須嚴格處理。未經處理的器皿、用具不得用于不同批。
1.3.3所用化學原料的規格應不低于化學純（三級純）或符合《中國生物制品主要原材料試行標準》規定。胃酶應力求活力高，粘液素含量少，類A血型物質含量低，并經過活力單位及類A血型物質含量測定。制造用水，應采取有效措施防止污染或產生熱原質。
1.3.4抗毒素精制的每步操作均應盡量除凈非抗毒素蛋白質，以提高制品純度。
1.3.5制造過程中加酸、堿及硫酸銨等時，速度不宜過快，避免局部濃度過高；酸、堿原液嘗試不宜超過2mol/L。操作時應盡量避免產生大量泡沫。應采取有效措施防止染菌和產生熱原質。除必要的操作時間外，應盡量縮短生產周期。
1.3.6制造過程中必須嚴格執行《生物制品分批規程》，不得將中間回收品并入不同批內。制造批號不同但制造方法與所含防腐劑相同并經檢定（無菌試驗、安全試驗、熱原質試驗）合格的半成品可進行合并，但合并批數不得超過2批。多價制品，其各單價半成品合并時，亦應符合上述原則。
1.3.7關于精制抗毒素再制的規定
1.3.7.1凡屬下列范圍的半成品及成品，可予再制。
（1）熱原質試驗結果陽性者。
（2）非肉眼可見而通過無菌試驗發現的染菌，經過濾不能除菌者。
（3）理化檢定不合格者。
（4）成品裝量不足者。
（5）超過效期的庫存制品。
（6）種類及制造方法相同，批號及數量清楚的分裝檢損品及濾器沖洗液可合并再制（但該批再制品的分裝檢損品應予廢棄）。
1.3.7.2再制方法可根據具體情況制定，但制成后的質量必須符合檢定要求。
1.3.8多價氣性壞疽抗毒素按下列單位比例進行混合。
威氏：水腫：膿毒=2∶2∶1。
必要時可加入1份溶組織抗毒素。
1.3.9制成之精制抗毒素，須在冷暗處保存至少1個月作為穩定期。
1.4半成品檢定
由制造部門進行理化檢定、無菌試驗、安全試驗、熱原質試驗、類A血型物質測定及效價測定。效價測定、類A血型物質測定及熱原質試驗可與質量檢定部門會同進行。檢定方法及要求同成品檢定。
2 成品檢定
由質量檢定部門進行全面檢定，半成品已會同檢定的項目可抽檢。
2.1鑒別試驗
每批成品至少抽取一瓶作以下鑒別試驗：
2.1.1作動物中和試驗（同效價測定）或免疫擴散試驗，以驗證本品系瓶簽標示的抗毒素。
2.1.2用兔抗馬血漿的兔Igg 與本品作免疫擴散試驗，以驗證本品為馬血清蛋白成分（如同一制造室無其他動物免疫血清生產，本試驗可免做）。
2.2理化檢定
2.2.1外觀
液體精制抗毒素應為幾乎無色或淡黃色的澄明液體，不得含有渣粒或異物，長期貯存后可有微量能搖散的沉淀產生。除血清本身及防腐劑的特有氣味外，不得有其他氣味。凍干精制抗毒素應為白色或微帶粉紅色的疏松體，加入規定量蒸餾水后輕輕搖動，應于15分鐘內完全溶解。溶解后的外觀應與液體精制抗毒素相同。
2.2.2固體總量及蛋白含量
液體精制抗毒素以及凍干制品的安規定量溶解后，固體總量不得超過20%（g/ml）。蛋白含量不得超過17%（g/ml）。
2.2.3pH值應為6.0～7.0。
2.2.4氯化鈉含量應為0.85%～0.95%(g/ml)。
2.2.5硫酸銨含量
液體精制抗毒素以及凍干制品按規定量溶解后，均不得超過0.1%（g/ml）。
2.2.6液體精制抗毒素的防腐劑，用三氯甲烷者不得超過0.5%（mlg/ml），用硫柳汞者不得超過0.01%（g/ml）。
2.2.7凍干精制抗毒素水分含量不得超過3%。
2.2.8電泳檢查
將樣品稀釋至2%蛋白濃度，做瓊脂糖電泳分析，應不含或僅含痕量白蛋白遷移率的蛋白。
2.2.9F（ab）2含量
用SDS-PAGE法（見《生物制品化學檢定規程》）測定，預防用抗毒素的F（ab）2含量不得低于50%，治療用抗毒素的F（ab）2含量不得低于60%。
2.3無菌試驗
按《生物制品無菌試驗規程》進行。
2.4安全試驗
取體重300～400g豚鼠2只，每只皮下注射精制抗毒素5ml，于第3至5日觀察局部，除輕度紅腫外，應無膿腫及壞死；第7日局部反應應消失，且體重不輕于注射前，如體重有輕微下降，可繼續觀察3日，如體重上升且高于注射前，可判為合格。
2.5熱原質試驗
按《生物制品熱原質試驗規程》進行，注射劑量為3ml/kg。判定標準按該4.1項要求進行。
2.6類A血型物質含量。
用血凝抑制法（附錄6）測定，類A血型物質不得超過4μg/ml。
2.7效價測定
2.7.1效價測定用標準抗毒素及試驗毒素由中國藥品生物制品檢定所統一定期分發。
2.7.2各種抗毒素的效價測定分別按附錄2～5進行。
2.7.3對各種抗毒素成品（凍干制品系按規定溶解后）的最低效價要求如下：
抗毒素種類IU/ml IU/gp
白喉預防用：2000 30000
治療用：3000 40000
破傷風預防用：2000 35000
治療用：3000 45000
氣性壞疽（多價）1000
氣性壞疽（威氏）1000 8000
氣性壞疽（膿毒）1500 12500
氣性壞疽（水腫）2500 20000
氣性壞疽（溶組織）2500 20000
A型肉毒3000 20000
B型肉毒3000 20000
E型肉毒3000 20000
3 保存
應保存在2～8℃冷暗干燥處。
4 效期
自效價測定合格之日起，精制抗毒素裝20%（不得低于16%）超量者，液體制品效期為5年，凍干制品效期為7年；裝10%（不得低于8%）超量者，液體制品效期為3年，凍干制品效期為5年。